La synthèse de l'acide nucléique est réalisée à l'aide de la méthode des triglycérides d'amide sialique en phase solide, dans laquelle l'extrémité 3' de l'ADN est immobilisée sur un substrat en phase solide et les nucléotides sont ajoutés dans la direction 3' vers 5' jusqu'à ce que le fragment d'ADN souhaité soit synthétisé. .Cela diffère de la synthèse de l'ADN par l'application de l'ADN polymérase.
L'extrémité 3' de la première base est immobilisée sur CPG lors de la synthèse, le 5′-OH de la base suivante est protégé par le di-p-tolyl trityl DMT, le groupe amino de la base est protégé par l'acide benzoïque et l'extrémité 3' -OH est ensuite activé avec un composé aminophosphate.1 base du 5 5′-OH de 1 base et 3′-OH de la base suivante forment un triglycéride phosphite, qui est ensuite oxydé avec de l'iode en un triglycéride phosphate, le protecteur sur la deuxième base 5′-OH est éliminé par l'ajout d'acide dichloroacétique DM passe par l'ajout de la base suivante, et après synthèse le protecteur sur le 5′-OH est éliminé avec un acide faible. Le fragment est déconnecté de la résine solide avec de l'hydroxyde d'ammonium concentré, le protecteur est retiré de la base. avec de l'hydroxyde d'ammonium concentré sous chauffage, l'hydroxyde d'ammonium est éliminé, le fragment est séché sous vide et l'acide nucléique est purifié par chromatographie liquide ou PAGE.
Étapes de la synthèse des oligo-éléments
Déblocage
LeLe groupe protecteur DMT à 5 extrémités est supprimé en ajoutant une solution TCA.
Activation
Mélanger l'activateur avec le monomère oligonucléotidique pour former l'intermédiaire monomère oligonucléotidique actif.
Couplage
Le groupe hydroxyle 5-terminal réagit avec l'intermédiaire oligonucléotide actif dans une réaction de condensation anti-générative pour former une liaison triglycéride phosphite instable.
Plafonnement
L'ajout d'un agent de coiffage effectue une réaction de coiffage d'acétylation avec des groupes hydroxyles en excès qui ne sont pas impliqués dans la réaction de condensation.
Oxydation
L'ajout d'une solution d'iode contenant de l'eau réagit avec les liaisons phosphites instables par oxydation pour former des liaisons triglycérides d'acide phosphorique stables.
Clivage cyanoéthyle
Le produit d'acide nucléique après synthèse, avec l'ajout d'une solution de DEA pour éliminer le groupe cyanoéthyle de la liaison triglycéride phosphate.
Clivé et déprotection
Les fragments d'acide nucléique sont clivés du support en phase solide en ajoutant une solution concentrée d'hydroxyde d'ammonium, puis chauffés pour éliminer les groupes protecteurs des liaisons hydrogène des bases.
Heure de publication : 21 novembre 2022